229 дней, 9 часов, 56 минуты

До всемирного дня диабета!

Можно ли компенсировать Диабет с помощью трансплантации инсулинопродуцирующей ткани в иммунопривелегированные зоны организма

Диабет — слово греческое и означает «сифон» или «протекать». Использование этого слова для обозначения заболевания, которое протекает с большим употреблением воды и быстрым её выведением из организма, принадлежит греческому врачу Аретерису Каппадокийскому (138-81 гг. до н. э.).

Первое клиническое описание заболевания проведено египетскими врачами за 1500 лет до нашей эры. Сахарный диабет был известен в Индии, Китае, Древней Греции и Италии. В работе индийского врача Сусрата (400 лет до н. э.) приведено не только клиническое описание болезни, но и её различные клинические формы. На основании вкуса мочи Томас Уиллис (1674) разделил диабет на Сахарный и несахарныи, безвкусный. М. Добсон (1776) установил, что сыворотка крови и моча больных Сахарным диабетом содержит сахар На этом основании М. Добсон однозначно указал, что сахарный диабет является системным заболеванием организма, а не первичной почечной болезнью. как считалось до этого.

Большая социальная значимость Сахарного Диабета состоит в том, что он приводит к ранней инвалидизации и летальности в связи с поздними сосудистыми осложнениями диабета, в числе которых — микроангиопатии (ретинопатия и нефропатия), макроангиопатии (инфаркт миокарда, инсульт, гангрена нижних конечностей), невропатии. Сахарный диабет — очень частая причина слепоты, смерти от уремии, велик риск развития сердечно-сосудистых заболеваний.

На фоне сахарного диабета летальность таких больных увеличивается в 2-3 раза. Риск развития ишемической болезни сердца и инфаркта миокарда возрастает более чем в два раза патологии почек — в 17 раз, гангрены нижних конечностей - в 20 раз, гипертонической болезни — более чем в три раза. Как следует из данных литературы, слепота, ампутация конечностей. Почечная недостаточность поражения сердечно-сосудистой системы и нейропатии. И другие патологии в значительно большей степени выражены у больных диабетом. чем у населения в целом. Но наиболее тревожны факты, что только 50% больных сахарным диабетом типа 1 доживают до 50 лет. Остальные погибают преимущественно от терминальной почечной недостаточности в возрасте от 20 до 40-50 лет. 

Сахарный диабет типа 1 — это болезнь, вызванная разрушением б-клеток островков Лангерганса поджелудочной железы в большинстве случаев аутоиммунного генеза. Аутоиммунная реакции против б-клеток может индуцироваться у лиц с генетической предрасположенностью, обусловленной несколькими генами, в том числе — генами области HLA на коротком плече 6-й хромосомы, под воздействием экзогенных факторов [вирусные инфекции, токсические вещества). Когда медленно и постепенно развивающийся диабет приводит к гибели 80-95 % инсулинпродуцирующих клеток. возникает абсолютный дефицит инсулина, приводящий к тяжелым метаболическим нарушениям. Лечение таких пациентов требует назначения пожизненной инсулинотерапии.

На сегодняшний день, как уже говорилось, главная причина высокой смертности пациентов с сахарным диабетом типа 1 — это поздние осложнения, такие как диабетическая микроангиопатия (ретинопатия, нефропатия, нейропатия) и макроангиопатия (атеросклерозу Развитие осложнений обусловлено хронической гипергликемией и сопутствующими метаболическими нарушениями.

К сожалению. достижение и поддержание постоянной нормогликемии оказывается довольно сложной задачей. и в подавляющем большинстве случаев результаты осавляют желать лучшего. В серии работ показано, что в нашей стране в поликлинических условиях не более 15 % больных компенсированы в достаточной мере, в то время как остальная часть находится в стадии субкомпенсации или декомпенсации. При этом, несмотря на относительно хорошее самочувствие и отсутствие выраженных клинических признаков декомпенсации, показатели углеводного обмена оказываются неудовлетворительными. Патогенетической терапией сахарного диабета типа 1 является экзогенный инсулин, однако заместительная терапия инсулином не позволяет восстановить функцию б-клеток. 

Частичное восстановление возможно после клинической манифестации заболевания, но продолжающийся процесс деструкции б-клеток приводит к полному переходу на заместительную терапию экзогенным инсулином. При этом известно, что какое-то время при уже текущем аутоиммунном процессе сохраняется нормальная секреция инсулина. Терапия даже высокоочищенными препаратами монокомпонентного человеческого инсулина не позволяет избежать специфических осложнений диабета и добиться полной компенсации всех видов обмена.

В связи с этим большое значение в последнее время приобретают исследования в области трансплантационных способов лечения сахарного диабета, но им всегда и в обязательном порядке должны предшествовать исследования и разработки по различным моделям экспериментальных эндокринопатий и других патологических состояний. О некоторых разработанных нами моделях мы расскажем ниже.

Задачей работы было создание экспериментальных моделей, позволяющих проследить различные Физиологические изменения в организме животных в период инициации, течения и трансплантологической компенсации аллоксанового диабета, а также максимальное продление периода нормогликемии у оперированных животных Основным отличием разработанных нами моделей от используемых ранее в биомедицинских исследованиях является то, что инсулинпродуцирующие клетки мы пересаживали в относительно иммунопривилегированные зоны организма — переднюю камеру глаза (ПКГ) и под белочную оболочку тестикул. Эти обстоятельства позволили не использовать после трансплантации иммунодепрессанты, при этом трансплантаты обеспечивали полную или частичную нормализацию всех исследованных показателей. Если в контрольной группе с острым аллоксановым диабетом (гипергликемия более 20 Ммоль/п) животные погибали, как правило, на сроках до 1 месяца, то после трансплантации эмбриональной или неонатальной поджелудочной железы в ПКГ или под белочную оболочку тестикул животные жили с полной либо частичной нормализацией основных физиологических показателей на сроках, соизмеримых с естественной продолжительностью жизни.

Материалы и методы

Получение экспериментального диабета

Эспериментальный диабет у крыс получали с помощью аллоксана Фирмы «Chemapol» «ДиаЭм», «Sigma», обладающего избирательным токсическим действием на б-клетки, продуцирующие инсулин. Внутрибрюшинно вводили 5 % раствор токсина из расчёта 200-280 мг сухого вещества на 1 кг массы тела. У кроликов экспериментальный диабет вызывали внутривенным введением 170 мг/кг 5 % раствора аллоксана. 

Алло- и Ксено-рансплантация поджелудочной железы в переднюю камеру глаза 

Для трансплантации отбирали животных, у которых в течение 2-х и более недель гликемия была не менее 19,5 ммоль/л, а глюкозурия, как правило, превышала 2%. В большинстве случаев гликемия составляла 21-25 ммоль/л. Пересадку ткани проводили в стерильных условиях. В работе использовали крыс-доноров с 17-18-дневной беременностью, для чего предварительно за 17-18 дней к 5 самкам подсаживали 1 самца.

В некоторых случаях в качестве доноров поджелудочной железы использовали новорождённых крысят.

Поджелудочную железу выделяли у эмбрионов под стереомикроскопом МБС-9. С хвостового конца железы отрезали 1-2 кусочка объёмом 0.84 мм, которые переносили в чашку Петри со стерильной средой Игла. Крысам-реципиентом с острым экспериментальным диабетом на глаз наносили по 1 капле 0,1 % раствора атропина и 0,5 % раствора дикаина. Трансплантацию проводили под эфирным наркозом.

Забирали материал из чашки Петри и трансплантировали его в переднюю камеру глаза туберкулиновым шприцом, фиксированным на препаратовводителе. На наконечник шприца надевали тефлоновую трубочку длиной 20 см, заполненную средой Игла. Трубочка заканчивалась стеклянным наконечником (внутренний диаметр 0.8 мм), куда и попадали трансплантаты.

Разрез длиной 1.5—2 мм производили простерилизованным глазным скальпелем либо лезвием, закреплённом в держателе. Трансплантаты общим объёмом 3-4 мм3 с помощью описанного приспособления медленно (7-10 сек) выдавливали и помещали на радужную оболочку глаза, как можно дальше от разреза Позднее в качестве инструмента для трансплантации стали использовать модернизированную микропипетку с изменяющимся объёмом от 5 до 25 мкл.

В случае ксенотрансплантации плодной железы человека или цыпленка объём пересаживаемого материала был в среднем 3-4 мм. в случае пересадки поджелудочной железы одномесячного поросёнка до 6 мм, что связано с меньшим количеством эндокринной ткани в их поджелудочной железе в сравнении с плодной поджелудочной железой иммунодепрессантов ни до операции, ни после не использовали. После операции животных содержали на стандартной диете.

Микрохирургический метод аллотрансплантации микрофрагментов ткани неонатальной поджелудочной железы в паравазальную клетчаточную щель семенника.

Метод трансплантации был разработан совместно с сотрудниками кафедры оперативной хирургии и клинической анатомии РУДН (проф. И. Д. Кирпатовским, с.н.с. В. Н Бродягиньнм, асп„ Ю. И. Кистнер). Операция проводилась под общей анестезией парами эфира. По средней линии живота выполнялся разрез длиной 2 см.

Левый семенник выводился в рану. В бессосудиетой зоне семенника производился прокол белочной оболочки. Строго под белочной оболочкой поверх семенных канальцев поочередно вводились микродилататорьл различного диаметра по ходу ларавазальной клетчаточной щели субкапсулярного сосудистого сплетения семенника. не проникая в паренхиму органа.

В результате формировался искусственный карман, расположенный поверх семенных канальцев. Затем в созданный карман паравазальной кпетчаточной щели вводились микрофрагментьт ткани поджелудочной железы объемом 25-30 мкл с помощью дозатора «MICROMAN».

После пересадки прокол белочной оболочки ушивался атравматичной иглой с нитью 6/0. Семенник обрабатывался антисептическим раствором мирамистина и помещался в мошонку.

Операционная рана ушивалась через все слои узловыми швами нитью 2-3/0.

После аллотрансплантации микрофрагментов неонатальнои ткани поджелудочной железы в семенник, с целью проведения в дальнейшем биологического теста для определения фертильности животных, у крыс без диабета осуществлялось односторонняя перевязка и пересечениесеменного протока интактногошравого) семенника.

Результаты

Наиболее высокий процент компенсации акспсримснтального диабета был получен, когда в качестве донора и реципиента использовали крыс Вистар (89%). Полная компенсация (3.8-8.8 ммоль/л) отмечалась у 153 оперированных животных (49 %), а частичная [8.8-13.8 ммоль/л) — у 124 крыс (40 %). Для того чтобы убедиться, что нет больших различий при разных вариантах аллотрансппантации, была проведена серия экспериментов по трансплантации эмбриональной поджелудочной железы беспородных крыс крысам Бистар. Компенсация диабета наступала у 81% животных, полная — у 15 оперированных животных (40.5%), и частичная - также у 15 животных (40.5%).

Использование кроликов для аллотрансплантации эмбриональной поджелудочной железы в ПКГ имеет свои недостатки и преимущества.

Кролики требуют повышенного, по сравнению с крысами, внимания при уходе за ними, особенно в период индукции диабета и плохо переносят наркоз. Зато являются идеальной моделью для проведения динамической тонометрии оперированных глаз. Этот тест в силу его неприспособленности для мелких грызунов нельзя провести на крысах.

Из 10 оперированных животных полная компенсация экспериментального диабета в течение срока наблюдения отмечалась у 3 кроликов, частичная — у 4, не было компенсации у 3 кроликов (погибли в течение месяца после операции).

В последней группе животных наблюдали выраженные признаки воспаления: наличие экссудата в передней камере глаза. Помутнение роговицы и хрусталика, У них экссудат в Передней камере рассосался на 7-10 сутки. но развилось стойкое помутнение роговицы вероятно, из-за значительного повреждения роговичного эндотелия во время трансплантации и контакта трансплантата, расположенного в прикорневой зоне радужной оболочки, с эндотелием роговицы.

Двум кроликам с полной компенсацией аллоксанового диабета через 4 месяца после операции провели удаление глаз с трансплантатами, после чего у животных в течение двух недель наступил рецидив диабета. У всех 7 кроликов с Полной или частичной компенсацией аллоксанового диабета провели динамическую тонометрию оперированных глаз. Повышение внутриглазного давления, по сравнению с парным глазом без трансплантата и с внутриглазньлм давлением контрольных животных, обнаружено не было.

Это говорит о том, что трансплантат не мешает нормальной циркуляции глазной жидкости и не блокирует Шлеммов канал, через который она оттекает от глаза, Как правило, трансплантат прикреплялся к радужной оболочке на том участке. куда его помещали во время операции.

Не было отмечено особенностей развития трансплантата в зависимости от места его локализации на радужной оболочке. Через 3-4 недели после операции начиналась различной интенсивности пигментация трансплантатов, так что со временем их было трудно различить на фоне радужной оболочки глаза.

Перед трансплантацией концентрация глюкозы в крови у подопытных животных была почти в 5 раз выше по сравнению с этим показателем у контрольной группы того же возраста. Мониторинг содержания глюкозы вёлся постоянно в течение всего эксперимента, как правило. 1 раз в неделю С помощью трансплантации фетальной поджелудочной железы (ФПЖ) в ПКГ удалось снизить высокую гипергликемию до уровня близкого к интактному контролю. Основным результатом этой части работы было то. что удалось показать возможность именно долговременной трансплантопогической компенсации высокой дооперационной гипергликемии.

Одним из важнейших показателей при инициации и компенсации диабета является, помимо количества глюкозы. содержание инсулина в крови. Из табл. 3 видно, что как количество глюкозы, так и количество иммунореактивного инсулина (ИРИ) после манифестации Экспериментального диабета достоверно различаются у интактных животных и крыс с аллоксановым диабетом. ИРИ у диабетических животных определялся в следовых количествах. его было в 39 раз меньше. чем у животных контрольной группы.

Через 4 месяца после трансплантации эмбриональной поджелудочной железы в ПКГ животных с аллоксановым диабетом показатели ИРИ и глюкозы ПОЛНОСТЬЮ нормализовались. Причём концентрация ИРИ у животныхс компенсированным диабетом была даже выше, чем у контрольных крыс.

В этой серии трём крысам с острым диабетом вместо поджелудочной железы Трансплантировали равные по объёму кусочки легкого (контроль на специфичность ткани), животные погибли при высоком уровне гипергликемии (более 20 ммоль/л) и глюкозурии (более 2%) через 7, 19 и 23 дня.

Количество глюкозы в моче — важный прогностический показатель. Как видно из таблицы, с помощью трансплантации удаётся добиться полной компенсации по этому параметру.

Одним из важных физиологических показателей, характеризующих как диабет типа 1 у человека. так и острый аллоксановьтй диабет у животных, повышенное повышенное потребление воды и, как следствие, полиурия. После трансплантации эмбриональной поджелудочной железы в ПКГ крыс с аллоксаноаым диабетом происходит снижение потребления воды в 3.8 раза и эти показатели достоверно не отличается от потребления воды интактными животными того же возраста.

Аллотрансплантация микрофрагментов ткани неонатальной поджелудочной железы в паравазальную клетчаточную щель семенника с целью компенсации экспериментального диабета 

Из-эа ограниченности объёма статьи в этой серии, мы остановимся на одном, наиболее прогностическом, показателе, а далее приведём только выводы по всей работе, касающейся трансплантации инсулинпродуцирующей ткани под балочную оболочку тестикул. Как видно из рис. 1. к 28 дню погибли все контрольные животные с аллоксановьлм диабетом.

Если же на 14 день после манифестации диабета проводилась трансплантация инсулинпроду цирующей ткани, уровень глюкозы снижался до значений, близких к норме.

Таким образом, с помощью новой методики удаётся полностью либо частично нормализовать исследованные физиологические показатели, состояние углеводного обмена в течение всего срока наблюдения.

Гистологические исследования показали выживаемость. трансплантатов и продукцию ими инсулина на всех сроках исследования 4, 6, 9 недель после пересадки.

Проведённое спаривание крыс на разных сроках после пересадки ткани поджелудочной железы в семенник с последующей перевязкой семявыносящего протока контралатерального интактного семенника показало полную сохранность фертильности у животных.